메틸렌불루염색에 의한 모발 손상 측정 방법론

[ Methylene Blue에 의한 손상도 측정 방법론 ]

Methylene blue  (메틸렌블루)

동물세포염색 시 사용되며 파란색을 띄게 된다.

MB염색법은 일반적으로 세포가 사멸하면 셀의 막이 파괴되어 염색이 되며 세포가 살아있으면 염색이 않되는

특성을 이용하여 세포 배양 시 세포의 사멸을 측정할 때 사용하는 방법으로 모발의 손상도 측정에 응용하기

위해서 손상모발에 MB염색 후 손상된 모발의 조직에 흡수된 MB용액을 다시 추출하여 손상의 정도를 측정

MB염색법을 이용한 모발 손상 측정방법

	2006.2.송팔용	2006.8.오명숙	2008.2.강갑연	2009.2.현지원
M.B 농도	20%	20%MB in phosphate buffer	20%	Methyl Violet B(hanawaGuaranteed Reagent)
흡착시간	10 분	1시간	1시간	30min
온도	50℃	상온	50℃
g,ml,		1ml	1ml	2gM/V B200ml
속도		1,000rpm	1,000rpm
NRDesorb Solution	알콜49%, 빙초산 15, 증류수 50%	알콜49%, 빙초산 15, 증류수 50%	알콜49%, 빙초산 15, 증류수 50%	알콜25%,빙초산1%,증류수 74%
abstraction 1차	5분	1시간, 1,000rpm	1ml, 5분	2ml, 1시간
"2차	희석후 5분	1시간 ,1,000rpm
분광강도계	Smart Spec3000, BIO-RAD	Smart Spec3000, BIO-RAD	Smart Spec3000, BIO-RAD	Photoelectric Colorimeter(model AE-11M,AE-11D
O.D	660nm	660nm	660nm	530nm

* 메틸렌블루(M.B, methylene blue)

* NR Desorb Solution(알콜 49%, 빙초산1%, 증류수50%)

논문 1. 송팔용 2006년 2월 석사논문

모발의 화학적 처리에 의한 손상도 측정 및 기계적 특성에 대한 연구

1.모발 손상도 측정 방법

1.1흡광도(absorbance)

2.시편제작

2.1탈색

모표피의 팽윤과 산화 촉진을 위해 1제인 28%NH₃ 와 멜라닌을 옥시멜라닌 (oxy-melanin)으로 산화 시켜 탈색을

일으키는 2제인 과산화수소(H₂O₂)를 '1:2'비율로 혼합하여 탈색제를 제조하였다. 모발의 손상을 비교하기 위해

과산화수소 농도 는 6%, 9%, 12%로 달리하고 탈색시간을 각 농도에서 10분, 20분, 30분처리하여 시편을 제작하였다.(조건1).

손상모발의 회복효과를 알아보기 위해 일반 미용실에서 사용되는 과산화수소 9%인탈색제와 분말(booster power)을

'1:1'로 혼합하여 정상모발에 바르고 30분(조건2), 60분(조건3)을 유지하여 탈색시편을 제작하였다.

2.2펌

정상모발에 1제인 치오글리콜산(6%, pH6)을 상온 25℃에서 10min유지하고 2제를 재 도포 하여 10분을 유지하여

펌 시편을 제작(조건4)

3.측정방법

모발손상을 측정하기 위해 분광강도계(spectrophotometer)를 이용하여 '조건1, 조거2, 조건3, 조건4, 조건 5'로 제작된

모발의 흡광도를 측정

4.탈색에 의한 모발의 손상도 변화

탈색처리된 시료는 50℃, 10min간 추출하여 희석한 후 다시 5min간 추출하여 분광강도계를 이용 흡광도를 측정하였다.

Table 4. Change of absorbance rate or bleached hair with various concentration of H₂O₂ and treat time.

-virgin		6%H₂O₂			9%H₂O₂			12%H₂O₂
		10min	20min	30min	10min	20min	30min	10min	20min	30min
O.D	0.368	0.394	0.438	0.53	0.438	0.567	0.721	0.711	1.048	1.308
%	100%	107%	119%	144%	131%	154%	196%	193%	284%	355%

탈색처리 조건에 따른 흡광도 측정결과 과산화수소의 농도 값이 증가할수록 흡광도 값은 증가하였으며 처리시간이

증가할수록 흡광도 상대 값도 증가하는 것을 볼 수 있다.

과산화수소에 의해 멜라닌색소과립의 파괴에 따른 미세기공 등의 발생이 주원인이며 그에 따라 내부조직의 결합파괴에

따른 모발손상이 부원인 으로 작용한 것으로 사료된다.

논문 2. 2006년 8월 오명숙

약제 및 열 펌에 의한 모발손상과 트리트먼트의 효과에 대한 연구

1.시료제작

시료모발은 콜드 펌과 열 펌으로 시술,  콜드 펌은 "치오글리콜산'으로,  열 펌은 '열 펌10min', 열 펌 20min으로

시술시간에 따라 각 각 표기하여 기술하였다.

펌 시술에 의한 모발손상 회복에 대한 4종류의 트리트먼트 제는 유형에 따라 solution type으로 polypeptide를

주성분으로 하는 type을 'P P T', gel type의 amino peptide를 주성분으로 하는 약제를 'A T P',

그 외의 type은 Pack1, Pack 2로 각 각 표기 하였다.

표현상 치오글리콜산을 "A", 열 펌 10min을 "B",열 펌 20min을 "C"로 표기하고 트리트먼트 유형별로

PPT"1", ATP "2", Pack1 "3", Pack2"4"로 표기 하고 펌 시술 전처리와 후처리로 표기 하였다.

2.모발 손상도 측정

Methylene Blue dye에 의한 흡광도 측정

Table 3. Comparison of hair damage according to perm through MB deing method

Optical density 660nm	Control	Treated	1(PPT)	2(APT)	3(Pack1)	4(Pack2)
		Perm
		(before/after)
Virgin hair	0.0063		0.000	0.0053	0.000	0.0040
Thioglycollic acid,(Cold perm)-A	0.817	before	0.1323*	0.1620*	0.2037	0.2057
		after	0.1693	0.2447	0.1440*	0.1690*
Thioglycollic acid,(Heat10min)-B	0.0450	before	0.0607	0.0420	0.0607	0.0437
		after	0.0483	0.0467	0.0433	0.0307
Thioglycollic acid,(Heat20min)-C	0.0120	before	0.0257	0.0310	0.0370	0.0547
		after	0.0257	0.0267	0.0435	0.0290

- 버진 헤어 흡광도 값보다 펌 시술 흡광도 값이 높 게 나온 것으로 보아 모발 손상을 확인 할 수 있었다.

- 열 펌에서 흡광도 값이 실험군 "B"보다 실험군 "C"의 흡광도 값이 낮 게 나타나 열변성에 의한 모발단백질의 경화로

인한 단백질의 응집현상으로 메틸렌불루의 흡광도 값이 낮 게 나온 것으로 보여 진다.

- 일반 펌과 열 펌의 손상의 차이를 흡광도로 그 차를 나타내기에는 더 많은 연구가 필요한 것으로 보여 진다.

- 트리트먼트 전처리에서 solution type의 실험군"1"과 실험군 "2"에서 낮은 것으로 보여 진다.

- 후처리에서는 Pack type의 실험군"3",실험군 "4"에서 낮 은 흡광도 값이 보여 진다.

- 흡광도 값이 펌을 시술한 모발보다 트리트먼트 제 처리 후 흡광도 값이   높게 나타나 트리트먼트제의 유효성이

확인 되지 않았다.

박사논문 3. 강갑연 2008년 2월

 

탈색 및 퍼머넌트제에 의한 모발 손상도 측정과 모발보호제 처리 효과

1.재료 및 방법

1.1사용 시약

본 실험에 이용한 hydrogen peroxide(H₂O₂),methylene blue (MB), cysteine, gelatin solution은 Sigma(U.S.A)에서

구입하여 사용하였다.

Gelatin 가수분해물은 10% 및 20% gelatin 용액에 단백질분해효소인Neutrase(Novozymes, Denmark)을 사용하여

50℃에서 6시간동안 가수분해 한 것을 사용하였다. Collagen 가수분해물은  B사 제품을 그대로 사용하였다.

NR desorb solution에 사용된 ethanol 및 glacial acetic acid는 시판1급 시약을 사용하였다. 퍼머넌트 웨이브 제는

한국A사 제품을 그대로 사용하였다.

2.시료 제작

2.1탈색 모발(bleached hair)

건강 모발시료에  탈색제 3%, 6%, 9%, 12%의 H₂O₂를 30분과 60분간 각각 처리하였으며 1차 처리 후 2주일(14day)

간격으로 2차와 3차처리를 하여 탈색을 시켜 H₂O₂의 농도(%)별로 탈색회수에 따른 탈색 모발 시편을 준비하였다.

2.2퍼머넌트 모발(permanent wave hair)

건강 모발시료에 손상 모발용 시스테인 퍼머넌트제와 건강모발용 치오 퍼머넌트제의 제품을 사용하여 시료 제작

2.3모발보호제 처리모발

화학처리에 의한 모발손상 전후에 모발보호제의 처리가 미치는 영향을 알아보기 위해 탈색과 퍼머넌트 후 그리고

탈색과 퍼머넌트 사이에 20% gelatin 가수분해물을 처리하였으며 ,

탈색 손상모발에10% gelatin가수분해물, 20%gelatin 가수분해물, 25% collagen가수분해물 및 0.005% cysteine등의

모발보호제를 위와 동일한 방법으로 준비하였다.

3.모발손상도의 측정

Methylene blue 염색법을 이용한 손상모발의 측정

3.1 MB염색법을 이용한 모발의 손상도

모발의 손상정도를 측정하기 위하여 건강모발과 6%H₂O₂로 1차, 2차, 3차로 각각 탈색하여 준비한 모발시료를 상용하여

MB로 염색한 후 추출한 MB의 양을 측정

virgin hair		6%H₂O₂bleached hair
		1차	2차	3차
O.D1차 추출	0.56	1.688	1.84	1.79
2차 추출	0.01	0.09	0.41	0.38

3.2. 손상모발에 대한 모발보호제의 효과

-Collagen가수분해물의 회복 효과 측정

virgin hair		6%H₂O₂bleached hair
		1차	2차	3차
O.D 기본값	0.56	1.688	1.84	1.79
Collagen25%가수분해물	0.439	1.49	1.65	1.719
%		6.826%	5.39%	-3.984%

* 이 실험에서 1차, 2차 실험 손상 모발에서는 신뢰할 수 있는 데이터 였으나 3차 손상모발에서 음(-)값으로

손상모발 회복측정에 신뢰할 수 없는 값으로 나타나 손상이 심할수록 손상된 모발의 회복에 효과가 없는 것으로 보인다.

                  손상모 보호제 처리후 흡광도- 처리후 건강모 흡광도

*회복율 = (1-      )x100                 손상모 보호제 처리전 흡광도 - 처리전 건강모 흡광도

- Cysteine의 회복효과 측정

	virgin hair		6%H₂O₂bleached hair
O.D			1차	2차	3차
	control	0.56	1.688	1.84	1.79
	0.005%Cysteine	0.428	1.449	1.496	1.546
	%		9.49%	16.56%	9.11%*

* 모발의 손상정도가 심한 시료 모발은 회복정도가 감소 하는 것으로 보여진다.

-Gelatin 가수 분해물 (10%,20%)의 회복효과 측정

O.D	virgin hair		6%H₂O₂bleached hair
			1차	2차	3차
	control	0.56	1.688	1.84	1.79
	Gelatin 10%	0.4516	1.3781	1.4599	1.4942
	%		17.86%	21.23%	15.34%
	Gelatin 20%	0.054	1.2189	1.4601	1.7048
	%		39.81%	28.12%	5.30%

* 20%Gelatin가수분해물이 10%Gelatin 가수분해물 보다 손상회복 정도가 낮게 나타나 모발회복제의 농도를 다르게

하여 손상모발의 회복 효과를 높일수 있을 것으로 생각된다.

박사논문 4. 2009년 2월 현지원

Silk Peptide를 포함하는 모발 화장품의 컨디셔닝 효과에 관한 연구

실험재료 및 방법

1. 모발 시료 제작

모든 손상 모발의 샘플은 화학적 탈색 처리( 탈색제 30분 적용 : 열처리 20분, 자연방치 10분)를 3회 반복하여 제작 되었다.

이 후 손상모에 실크펩타이드 컨디셔너 처리 과정을 거친 모발 샘플들은 실험군으로, 나머지 샘플들은 대조군으로

구분한 후 실크 펩타이드 컨디셔너 처리에 따른 recovery effect를 관찰하였다.

2. 시약

본 실험에 이용한 bleach powder는 Wella사의 Blondor, hydrogen peroxide는 Loreal사의 Oxydant cream 9%를

사용하였으며, NR desorbed solution에 사용된 ethanol및 Meghyl Violet B (Hanawa Guaranteed Reagent)는

국내 H연구소에서 구입하여 사용하였다.

헤어 컨디셔너 제조에 사용된 실크 펩타이드는 농촌진흥청 잠사 양봉 소재과(수원)로부터 지원을 받은 것으로,

가잠(Bombyx mori)을 전령 상엽으로 사육하여 얻은 누에고치를 정련하여 사용하였다.

3. Silk peptide 헤어 컨디셔너 제조

실크 펩타이드 컨디셔너(silk peptide conditioner)는 분자량 24의 실크 펩타이드와 분자량 1400의 실크 펩타이드

두 가지 타입을 제조하고 성분 함량차이를 두어 샘플제조, 각각 0.5%, 2%, 5% 씩 성분 변화를 주었다.

4. 헤어 컨디셔너 처리 방법

트리트먼트 방법은 탈색처리가 끝난 뒤 흐르는 물에 닦고 건조 후에 약 1g의 모 다발에 1g의 에멀젼 타입의 헤어

컨디셔너를 도포하고 랩 사용 후 재문열처리 한 후 10분 자연방치가 끝나면 흐르는 미온수에 세척하여 상온에서

자연건조 시키고 이 방법을 3회 반복처리한 후 실험하였다.

분자량 240 silk peptide conditioner를 처리한 모발 샘플은 'A'군 1400 silk peptide concitioner를 처리한

모발 샘플은 'B'군으로 명기 하였다.

Table 7. List of hair samples

List of hair samples
Sample		Treated	Name	Treatment type
1.	Virgin hair	-	-	no treatnent
2.	Damaged hair	-	-	no treatnent
3.	Damaged hair	Treated	control	no silk peptide
4.	Damaged hair	Treated	A0.5	with o.5% Mw 240 conditioner
5.	Damaged hair	Treated	A2	with 2% Mw 240 conditioner
6.	Damaged hair	Treated	A5	with 5% Mw 240 conditioner
7.	Damaged hair	Treated	B0.5	with o.5% Mw 1400 conditioner
8.	Damaged hair	Treated	B2	with 2% Mw 1400 conditioner
9.	Damaged hair	Treated	B5	with 5% Mw 1400 conditioner
10i.	Damaged hair	Treated	A2B2	with 2% Mw 240 +2% Mw 1400 conditioner

흡광도 Methyl Violet B 염색을 이용한 모발 내 침투 효과

Silk peptide의 분자량에 따른 모발 내 침투 효과 비교

Table 10. Change of absorbance rate according to the treated times of silk peptide conditioner

Absorbance rate (O.D, %)
T	V.H.	D.H.	C.	A 0.5	A 2	A 5	B 0.5	B 2	B 5	A2B2
1	0.09	0.47	0.32	0.24	0.2	0.25	0.35	0.36	0.3	0.28
2	0.1	0.4	0.27	0.2	0.14	0.17	0.16	0.18	0.24	0.14
3	0.1	0.34	0.3	0.1	0.07	0.085	0.082	0.09	0.12	0.07

* T: Treatment, V.H ; Virgin hair, D.H: Damaged Hair, C: Control

- 240Silk peptide의 2%의 "A2"컨디셔너가 횟수에 따라 현저히 낮은흡광도 값을 보였으며, A2가 가장 효과적으로

모발 내부에 침투해 컨디셔닝 효과가 준 것으로 판단되며, 1400 Silk peptide B0.5와 B2에서도 흡광도 값이 감소되어

모발의 모피질 내부를 채운 것으로 보인다.

결론

메틸렌불루(Methylene blue)의 흡광도(optical density O.D) 측정 방법으로 분석한 모발손상도 비교 분석에 의한

측정 기준의 필요성을 확인하며,

MB염색으로 모발의 손상 정도에 따라 흡광도 값을 비교 분석 하였을 때 탈색, 퍼머넌트 등의 시술 횟수를 더 할수록

모발의 손상 이 흡광도 값의 증가로 확인 되었으며,  모발컨디셔너제의 type에 따라 정도의 차이가 있으나 흡광도 값이  

감소하는 것으로 확인되었다. 단 열 펌에서 열 가소성에 의한 모발 손상이 환원제에 의한 손상과 구분하여 손상을 확인

할 수 있는 기준이 필요하며, 그것을 흡광도 값으로 나타낼 수 있다면 MB염색에 의한 모발손상지수의 기준을 만드는데

완벽한 손상도 기준 지표로 모발의 손상지수를 나타내는데 실효성이 있을 것으로 분석되나 MB 측정시의 농도, 온도,

시간, 추출 시약 등을 다양하게 실험하고, 그것을 표본으로 표준 설계를 하여 흡광도 값을 측정 하였을 때, MB염색에

의한 흡광도 값이 손상을 측정하는 분석 방법의 한 부분을 담당 할 것으로 생각됩니다.

* 본 자료는 향장미용과학연구소 오명숙 회원님의 '메틸렌블루측정법'에서 자료를 copy하여 가져왔습니다.